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      超纯质粒大量提取试剂盒-----去内毒素、去蛋白

GalaxyBio Code包装规格价格说明书购物车
FP09310880元
FP094503800元

超纯质粒大量提取试剂盒-----去内毒素、去蛋白

产品简介     
※  本试剂盒采用经典的SDS碱裂解法裂解细胞,离心吸附柱内的硅胶膜在高盐低pH值状态下选择性地结合溶液中的质粒DNA,再通过去蛋白液和漂洗液将杂质和其它细菌成分去除,最后低盐,高pH值的洗脱缓冲液将纯净质粒DNA从硅胶膜上洗脱。
  ※  具有高效率的内毒素去除液,有效去内毒素,经检测,一次分离即符合国家药典内毒素含量标准。非常适合转染、转化及动物免疫及各种分子生物学实验。
  ※  快速、方便,从150~250 ml大肠杆菌LB(Luria Bertani)培养液中,可快速提取500~1000ug纯净的高拷贝质粒DNA,提取率达85~90%。
  ※  获得的质粒产量高,超螺旋比例高、纯度好。直接可以用于酶切、转化、PCR、体外转录、测序等各种分子生物学实验。
操作步骤:
1.试验前准备及注意事项
 a. 溶液S1 Resuspension Buffer 使用前将RNase A(使用前稍离心)全部加入,均匀混合后4℃保存并标示。
     b. Wash Buffer 使用前请按标签加入无水乙醇并标示。
     c. 使用前检查溶液S2、溶液S3各试剂是否有沉淀,若有请于37℃或微波炉稍加热溶解。S2可以在不烫手时使用,S3室温使用。
     d. 溶液S2、溶液S3及去内毒素溶液S4用后拧紧瓶盖。
2.  收菌  取150~250ml 在LB 培养基中培养过夜的高拷贝数质粒菌液,或500 ml 过夜培养的低拷贝质粒/Cosmid菌液(若使用丰富培养基,菌液体积应减半或更少),≥3,000×g 离心10 min,弃上清。将离心管倒置于纸巾上数分钟,除尽上清。
  * 当过夜菌液大于250ml时,可以根据菌体量的多少,严格按比例适当加大Buffer S1、S2、S3的使用量,可以得到更好的收率。下表供参考。
  
 培养过夜菌液和各溶液的关系(供参考)

菌液
溶液S1
溶液S2
溶液S3
150~250ml
10ml
10ml
14ml
250~350ml
12ml
12ml
17ml
500ml左右
14ml
14ml
20ml

3.  重悬菌液  加10ml Buffer S1 悬浮细菌沉淀,悬浮需均匀,不应留有小
菌块。
* 确认Buffer S1 中已加入RNase A请充分重悬细菌,若不充分会导致碱裂解不完全。
4.  碱裂解  加10ml Buffer S2,温和并充分地上下翻转8-10 次混合均匀使菌体充分裂解,直至形成透亮的溶液。
* Buffer S2 使用后立即盖紧瓶盖,以免空气中的CO2 中和Buffer S2 中的NaOH,降低溶菌效率。
* 避免剧烈摇晃,否则将导致基因组DNA 的污染。
* 此步骤不宜超过5 min
* Buffer S2 后裂解液会变成蓝色,充分混匀以保证形成均一的蓝色溶液。
5.  中和  加14ml的Buffer S3,温和并充分地上下翻转10-12 次混合均匀,直至形成紧实的凝集块,室温放置5 min。
* 加入Buffer S3 后应立即混合,以避免形成局部的凝结块。
* 避免剧烈摇晃,否则将导致基因组DNA 的污染。
* Buffer S3 后蓝色会消失,充分混匀以保证悬浮物中蓝色均消失。
6. 过滤 将上清全部转入过滤柱,一般可以靠重力过滤,也可适当3000×g 离心min,。
 
7.  去内毒素
a..将上述操作的上清液体转移另一离心管中(忌取到沉淀),加10ml 去内毒素S4,振荡混匀,
b.不时振荡数次每次30秒。
c. 10,000 rpm,30℃离心5 min。
 d. 溶液分为两相。上层水相含DNA,下层油状相含内毒素。
8.  柱结合.将含DNA的上层水相转移到吸附柱Spin Column中,弃层油状相。宁肯少提上层水相,也不要不要吸到中间层。一般一次抽提就可以符合标准;也可以根据需要重复抽提2次,即重复步骤a-d两次
    10,000×g 离心2 min,弃滤液。如过滤不完全,可以适当延长离心时间。
9.  漂洗  将13ml的漂洗缓冲液 加入吸附柱中,10,000×g 离心(4°C)2 min,弃滤液。
10. 再漂洗  将13ml的漂洗缓冲液 加入吸附柱中,10,000×g 离心(4°C)2 min,弃滤液。 空柱10,000×g 离心(4°C)2 min,除去残留乙醇。
11. 洗脱  将吸附柱置于洁净的50 ml 离心管中,在吸附柱的膜中央上加1.5 ~3.5ml Elution Buffer,室温 静置5 min。≥10,000×g 离心5 min 收集质粒DNA。
    注意:Elution Buffer 组成为2.5mM Tris-HCI (pH8.5),不影响测序和酶切反应,把水或洗脱液加热于65℃使用时有利于提高洗脱液效率,如果提取的质粒>10kb,请将洗脱液预热至65℃,并适当延长洗脱时间
 
质粒DNA浓度和纯度检测
   OD260值为1,相当于50ug/ml的双链DNA。也可以通过DNA Marker通过琼脂糖凝胶电泳半定量。
   OD260/ OD280比值一般为1.7-1.8,如果洗脱时不使用缓冲液,而使用去离子水,由于受PH值和离子浓度的影响,比值会偏低。
 
 
 
 


 

超纯质粒DNA大量提取试剂盒
              (去内毒素、去蛋白)
 

  试剂盒内容
10 TESTS
Cat:FP093
50 TESTS
Cat:FP094
RNaseA (10mg/ml)
300ul×5
300ul×25
溶液S1    Resuspension Buffer
125ml
125 ml×5
溶液S2    Lysis Buffer 
125ml
125 ml×5
溶液S3    Neutralization Buffer
145ml
145 ml×5
105ml
105 ml×5
漂洗缓冲液Wash Buffer
30 ml×2
30 ml×10
洗脱缓冲液 Elution Buffer
15 ml×2
15ml×10
过滤柱    Filter Column
10
50
吸附柱     Spin Column
10
50
收集管  Collection Tube(50ml)  
20
100
说明书     Specification
1
1

 
贮存条件:
室温,有效期一年。溶液S1加入RNase后2-8℃保存

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