超纯质粒DNA小量提取试剂盒
（去内毒素、去蛋白）
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试剂盒内容 |
50次 货号cat:FP050 |
100次货号cat:FP060 |
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RNaseA (10mg/ml) |
150ul |
300ul |
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溶液S1 Resuspension Buffer |
15 ml |
30 ml |
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溶液S2 Lysis Buffer |
15 ml |
30 ml |
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溶液S3 Neutralization Buffer |
25 ml |
45 ml |
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25ml |
45 ml |
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漂洗缓冲液 Wash Buffer |
15 ml |
30 ml |
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洗脱缓冲液 Elution Buffer |
10 ml |
20 ml |
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吸附柱 Spin Column |
50 |
100 |
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收集管 Collection Tube(2ml) |
50 |
100 |
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说明书 Specification |
1 |
1 |
贮存条件：
室温，有效期一年。溶液S1加入RNase后2-8℃保存
产品简介
※ 本试剂盒采用经典的SDS碱裂解法裂解细胞，离心吸附柱内的硅胶膜在高盐低pH值状态下选择性地结合溶液中的质粒DNA，再通过去蛋白液和漂洗液将杂质和其它细菌成分去除，最后低盐，高pH值的洗脱缓冲液将纯净质粒DNA从硅胶膜上洗脱。
※ 具有高效率的内毒素去除液，有效去内毒素，经检测，一次分离即符合国家药典内毒素含量标准。非常适合转染、转化及动物免疫及各种分子生物学实验。
※ 快速、方便，从1～5 ml大肠杆菌LB（Luria Bertani）培养液中，可快速提取15-40ug纯净的高拷贝质粒DNA，提取率达85～90%。
操作步骤：
1.试验前准备及注意事项
a. 溶液S1 Resuspension Buffer 使用前将RNase A全部加入（使用前离心），均匀混合后4℃保存并标示。
b. Wash Buffer 使用前请按标签加入无水乙醇并标示。
c. 使用前检查溶液S2，若有请于37℃或微波炉稍加热溶解。S2可以在手握不烫手时使用。
d. 溶液S2 Lysis Buffer、Buffer S4及洗脱液用后拧紧瓶盖。
e. 产品具有腐蚀性，注意防护。如接触，请用大量水冲洗并及时就医。
2. 收菌 取1～5ml过夜培养的菌液，12000rpm离心1分钟，弃上清。
注意：一般高拷贝质粒用1-3ml菌液，低拷贝质粒用2-10ml菌液。若使用大体积菌液，请相应加大各溶液的体积。
3. 重悬菌液 将250μl溶液S1 Resuspension Buffer(已加RNase A)加入菌液沉淀，Vortex充分悬浮细菌沉淀。
注意：请充分重悬细菌，若不充分会导致碱裂解不完全。
4. 碱裂解 将250μl溶液S2 Lysis Buffer 加入细菌重悬液，温和地上下翻
转混合6～10次，使菌体充分裂解，直至溶液变得清亮。
注意：此步请轻柔混合，剧烈混合如Vortex会导致基因组DNA断裂，从而污染质粒DNA。
碱裂解不宜超过5分钟，否则会导致部分质粒DNA不可逆变性。
5. 中和 加入350μl溶液S3 Neutralization Buffer,立即轻柔地上下翻转混合直至蓝色彻底消失。室温放置5分钟后，室温12000rpm离心10分钟。
6. 去内毒素：
a..将上述操作的上清液体转移另一离心管中(忌取到沉淀)，加400μl S4,振荡混匀，
b.不时振荡数次每次30秒。
c. 12,000 rpm,30℃离心5 min。
d. 溶液分为两相。上层水相含DNA，下层油状相含内毒素。
e.将含DNA的上层水相转移到吸附柱Spin Column中，弃层油状相。宁肯少提上层水相，也不要不要吸到中间层。一般一次抽提就可以符合标准；也可以根据需要重复抽提2次，即重复步骤a-d两次。
7. 柱结合 12000rpm室温离心1分钟，弃滤液。
9. 漂洗 将700μl的Wash Buffer加入吸附柱Spin Column中，12000rpm室温离心30-60秒，弃滤液。
10. 再漂洗 将700μl的Wash Buffer加入Spin Column中，12000rpm离心30-60秒，弃滤液。 空柱12000rpm再室温离心2分钟，除去残留乙醇。
11. 洗脱 将Spin Column按置于新的洁净的1.5ml的离心管上，在吸附柱Spin Column树脂沉淀中央处加入50-100μl的水或洗脱缓冲液Elution Buffer，室温静置1分钟，12000rpm离心1分钟洗脱DNA，可立即用于下游分子生物学实验或-20℃保存。
注意：Elution Buffer 组成为2.5mM Tris-HCI (pH8.5),不影响测序和酶切反应，或以PH8.5的去离子水代替。把水或洗脱液加热于60℃使用时有利于提高洗脱液效率，如果提取的质粒>10kb，请将洗脱液预热至60℃，并适当延长洗脱时间。
质粒DNA浓度和纯度检测
OD260值为1，相当于50ug/ml的双链DNA。也可以通过DNA Marker通过琼脂糖凝胶电泳半定量。
OD260/ OD280比值一般为1.7-1.8，如果洗脱时不使用缓冲液，而使用去离子水，由于受PH值和离子浓度的影响，比值会偏低。
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