一、 简介
Protein G是从G类Streptococci细菌中分离出来的胞壁蛋白，与多数哺乳动物的IgG Fc段结合(包括：人、山羊、绵羊、兔、豚鼠、马、猪、猴、小鼠等)，分子量：25kDa。Protein G可用于纯化不能与Protein A很好结合的哺乳动物单抗和多抗IgG的纯化。相对于Protein A，Protein G对于大多数哺乳动物的IgG有着更高的亲和力，尤其是对于IgG的亚基，如人 IgG3，小鼠IgG1和鼠 IgG2a。与Protein A不同，Protein G不与狗IgG结合、不结合人IgM，IgD，或IgA。
重组蛋白G(Recomb Protein G)已经除去了与白蛋白及细胞表面结合位点，减少了交叉反应和非特异性结合。因此，它比天然蛋白G和蛋白A有更大的亲和力。可以代替二抗，广泛应用于免疫化学等领域。在亲和力、稳定性等方面好。
本产品将我公司自主设计和生产的新型重组蛋白G偶联到环氧活化的琼脂糖凝胶6B上，成为用于抗体分离纯化的亲和层析介质
本产品稳定性好，基团脱落少，使用寿命长，使用方便，可从腹水或培养液中直接分离纯化抗体。
由于采用了环氧活化的方法，与溴化氰活化方法相比，可获得长短更适合的结合臂，使抗体纯化获得更好的效果。并且这种方法活化的琼脂糖凝胶没有离子交换的作用，因而其死吸附少。
二、 亲和介质特性：
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特点 |
基团脱落少，结合特异性强 |
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基质 |
6% 的交联琼脂糖凝胶 |
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配基 |
重组蛋白G |
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配基密度 |
≈6mg 重组蛋白G/ml |
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吸附载量 |
3-7mg 鼠IgG2a/ml |
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亲和介质的颗粒大小 |
50-160μm |
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最大流速 |
200cm/h |
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pH 范围 |
3-10 ，在位清洗时pH 范围可到2-11 |
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使用温度 |
常温 |
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保存温度 |
+4~8℃ |
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保存液体 |
20% 乙醇 |
三、 适用范围
Protein A和Protein G的相对结合强度
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物种物种 |
亚类亚类 |
protein A 结合 |
protein G 结合 |
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人 |
lgA |
可变 |
- |
|
|
lgD |
- |
- |
|
|
lgD |
- |
- |
|
|
lgG1 |
++++ |
++++ |
|
|
lgG2 |
++++ |
++++ |
|
|
lgG3 |
- |
++++ |
|
|
lgG4 |
++++ |
++++ |
|
|
lgM |
可变 |
- |
|
鸡蛋黄 |
lgY |
- |
- |
|
牛 |
|
++ |
++++ |
|
狗 |
|
++ |
+ |
|
山羊 |
|
- |
++ |
|
豚鼠 |
lgG1 |
+++ |
++ |
|
|
lgG2 |
+++ |
++ |
|
仓鼠 |
|
+ |
++ |
|
马 |
|
++ |
++++ |
|
考拉 |
|
- |
+ |
|
骆驼 |
|
- |
+ |
|
猴(恒河) |
|
++++ |
++++ |
|
小鼠 |
lgG1 |
+ |
++++ |
|
|
lgG2a |
++++ |
++++ |
|
|
lgG2b |
+++ |
+++ |
|
|
lgG3 |
++ |
+++ |
|
|
lgM |
可变 |
- |
|
猪 |
|
+++ |
+++ |
|
兔 |
|
++++ |
+++ |
|
大鼠 |
lgG1 |
- |
+ |
|
|
lgG2a |
- |
++++ |
|
|
lgG2b |
- |
++ |
|
|
lgG3 |
- |
++ |
|
绵羊 |
|
+/- |
++ |
++++ =强结合，++ =中等结合，- =弱或不结
四、 缓冲液配制
建议采用磷酸缓冲液，洗脱后不影响下游的标记。
A缓冲液 1mol/L Na2HPO4.12H2O(MW358.14)……………… 358.14g
1500 mM NaCl l(MW68.08g/mol) ………………… 87.7g
溶于1升水，滤膜过滤
B缓冲液 1mol/L NaH2P04 (MW156.01) ………………………156.01g
1500 mM NaCl l(MW68.08g/mol) ………………… 87.7g
溶于1升水，滤膜过滤
C 吸附亲和洗涤缓冲液
根据所需PH值，按下表3配制。按照所列比例量取后混合，然后再加9倍体积的水，稀释成应用溶液。
如果洗脱下的抗体有些杂带，可加吐温-20至终浓度0.05%
D 推荐亲和缓冲液:A液77.4ml 、B液22.6ml；两液混合成PH7.4的亲和缓冲液，再加9倍体积的水，稀释成应用溶液
E 洗脱液 0.1mol/L NaH2P04 (MW156.01) ………………………15.601g
150 mM NaCl l(MW68.08g/mol) ……………………… 8.77g
溶于1升水，滤膜过滤，HCl调整PH至2.0～3.0
五、应用举例
A 实验名称：从小鼠腹水中分离纯化IgG2a
1、 重组蛋白G 琼脂糖凝胶装柱，柱床体积为1ml，流尽20%乙醇溶液；
2、 以缓冲液C平衡5-10个床体积，流速为1ml/min；（缓冲液C配制方法：取A液35.2ml、B液64.8ml，再加900ml水，混合后PH6.5）.
3、 将0.2ml小鼠腹水用缓冲液C稀释到2ml，0.45μm 滤膜过滤，上样。流速为1ml/min；
4、 用缓冲液C再洗5-10 个床体积，流速为1ml/min；
5、 用洗脱液E,洗脱3体积。
6、 在洗脱液加入0.2体积中和缓冲液，以PH试纸确认溶液为中性。溶液太酸，会损伤抗体活性（中和缓冲液配制方法：A液77.4ml 、B液22.6ml；两液混合成PH7.4的中和缓冲液
7、 将分离纯化的IgG2a 与对照品同时进行SDS-PAGE 电泳分析。
8、 用纯水流洗10个柱床体积，再用20%的乙醇流洗10 个柱床体积，流速为2ml/min，
柱子置于+4~8℃环境中保存
表三，25℃下0.1mol/L磷酸钠缓冲液的配制
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pH |
A液
1mol/L Na2HPO4(ml) |
B液
1mol/L NaH2PO4(ml) |
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5.8 |
7.9 |
92.1 |
|
6.0 |
12.0 |
88.0 |
|
6.2 |
17.8 |
82.2 |
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6.4 |
25.5 |
74.5 |
|
6.6 |
35.2 |
64.8 |
|
6.8 |
46.3 |
53.7 |
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7.0 |
57.7 |
42.3 |
|
7.2 |
68.4 |
31.6 |
|
7.4 |
77.4 |
22.6 |
|
7.6 |
84.5 |
15.5 |
|
7.8 |
89.6 |
10.4 |
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8.0 |
93.2 |
6.8 |
根据比例量取混合，然后在加9倍体积的水，稀释成应用溶液。
B 免疫沉淀(Immunoprecipitation, IP)：
（1）蛋白样品的准备：
1） 对于10厘米细胞培养皿中的贴壁细胞，吸除细胞培养液，PBS洗涤一次，然后加入500微升至2毫升细胞裂解液裂解细胞。
3） 对于组织样品参考贴壁细胞使用裂解液的比例进行裂解。
4） 对于悬浮细胞，离心收集细胞后，PBS洗涤一次，然后参考贴壁细胞的裂解方法进行裂解。
注： 详细的裂解方法参考不同裂解液的详细使用方法。对于不同的培养器材，参考10厘米培养皿的裂解液的用量进行裂解。如果裂解获得的蛋白样品浓度过高，可以用裂解液或PBS适当稀释，如果蛋白样品浓度过低，在以后的裂解过程中宜适当减少裂解液的用量。
（2）. 去除非特异性结合(可选做)：
1）. 取200微升至1毫升蛋白样品，蛋白量约为200微克至1毫克，加入约1微克和免疫沉淀时使用的IgG种属相同的普通IgG和20微升充分重悬的Protein A+G Agarose，4℃缓慢摇动30分钟至2小时。
2）. 2500rpm(约1000g)离心5分钟，取上清用于后续的免疫沉淀。
注： 所谓种属相同的IgG是指，例如后续免疫沉淀时用的是小鼠IgG，则在本步骤中可以加入normal mouse IgG，如无normal IgG可以加入其它不影响后续检测的其它mouse IgG类型的抗体。通过和normal IgG和Protein A+GAgarose的孵育，可以充分降低非特异性的结合，降低背景。
（3）. 免疫沉淀：
1）. 加入0.2-2微克用于免疫沉淀的一抗，4℃缓慢摇动过夜。
2）. 再加入20微升充分重悬的Protein A+G Agarose，4℃缓慢摇动1-3个小时。(为方便后续的洗涤操作可以把加入充分重悬的Protein A+G Agarose的量调整为40微升。)
3）. 2500rpm(约1000g)离心5分钟，或瞬时高速离心，小心吸除上清，注意宁可留下少量上清也不能吸掉Protein A+GAgarose。
4）. 用准备蛋白样品时的裂解液或PBS洗涤沉淀5次，裂解液或PBS的用量每次为0.5-1毫升。洗涤时离心条件和吸除上清的要求同上面的步骤C3。
5）. 完成最后一次洗涤后，去除上清，加入20-40微升1XSDS-PAGE电泳上样缓冲液Vortex重悬沉淀，瞬时高速离心把样品离心至管底。
6）. 100℃或沸水浴处理3-5分钟，取部分或全部样品用于SDS-PAGE电泳，暂时不用的样品可以-20℃保存。
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