酵母质粒小量提取试剂盒
（离心柱型）
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试剂盒内容 |
50次货号Cat:YP010 |
50次货号Cat:YP010 |
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Lyticase (1KU/ml) |
1500μl×2 |
1500μl×4 |
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RNaseA (10mg/ml) |
150μl |
300μl |
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溶液SE Buffer SE |
15ml |
15ml×2 |
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溶液S1 Resuspension Buffer |
15ml |
30ml |
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溶液S2 Lysis Buffer |
15ml |
30ml |
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溶液S3 Neutralization Buffer |
25ml |
45ml |
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漂洗缓冲液 Wash Buffer |
15ml |
30ml |
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洗脱缓冲液 Elution Buffer |
10ml |
10ml |
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吸附柱 Spin Column |
50 |
100 |
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收集管 Collection Tube(2ml) |
50 |
100 |
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说明书 Specification |
1 |
1 |
贮存条件：Lyticase、RNaseA和其他试剂都可以室温保存
产品简介
※ 本试剂盒采用酶法或机械破壁酵母细胞，离心吸附柱内的硅胶膜在高盐低pH值状态下选择性地结合溶液中的质粒DNA，再通过去蛋白液和漂洗液将杂质和其它细菌成分去除，最后低盐，高pH值的洗脱缓冲液将纯净质粒DNA从硅胶膜上洗脱。
※ 采用进口硅胶膜，吸附量大，最大45ug，产率高。
※ 通常酵母质粒拷贝数都很低，一般通过电泳或者分光光度计法不容易难检测到。提取的质粒DNA 如用于下列实验，通常建议使用量为：
用作PCR 模板：1-5 μl 质粒DNA。
转化大肠杆菌：5-10 μl 质粒DNA。
※ 获得的质粒直接可以用于酶切、转化、PCR、体外转录、测序等各种分子生物学实验。
操作步骤：
1.试验前准备及注意事项
a.溶液S1 Resuspension Buffer加入RNaseA，并标示，4℃保存。
漂洗缓冲液 Wash Buffer使用前请按标签加入无水乙醇并标示。
b.使用前检查溶液S2 Lysis Buffer ，若有请于37℃或微波炉稍加热溶解。
c.溶液S2 Lysis Buffer 及洗脱液用后拧紧瓶盖。
2.收集1～5ml培养液，1000xg，离心 5 min，尽量弃去上清。
注意:残余培养液影响酶解.
3.酵母细胞壁的破除：
a.酶法：向菌体中加入 300μl Buffer SE 能，加入大约50μl Lyticase (约50U) ，充分混匀，并在摇床上 220rpm / min , 30℃处理30 min ～1小时。3000 x g离心 5 min，沉淀原生质球，小心弃去上清，收集沉淀。加入 250μl溶液S1 Resuspension Buffer（请先检查是否已加入 RNaseA ) 重悬沉淀。
注意：以上 Lyticase 的用量和处理时间为经验值，根据酵母菌株和酵母细
胞数量的不同，所用 Lyticase 的浓度和孵育时间应该进行适当调整。对于
酵母的不同菌株，孵育时间和酶量有所不同，后续操作裂解的程度取决于原生质球的数量。原生质球. 必须小心操作。
b.玻璃珠法：向菌体中加入 250μl溶液S1 Resuspension Buffer（请先检查是否已加入 RNaseA ) 重悬沉淀，彻底悬浮菌体。加入 0.1g 直径为0.45～0.55mm 的酸洗玻璃珠，涡旋振荡 10 分钟。让玻璃珠自然下沉，转移裂解液至一个新离心管.
.8. 碱裂解 将250μl溶液S2 Lysis Buffer 加入细菌重悬液，温和地上下翻转混合6～10次。
注意：此步请轻柔混合，剧烈混合如Vortex会导致基因组DNA断裂，从而污染质粒DNA。碱裂解不宜超过5分钟，否则会导致部分质粒DNA不可逆变性。
9. 中和 加入350μl溶液S3 Neutralization Buffer,立即轻柔地上下翻转混合直至蓝色彻底消失。室温放置5分钟。室温12000rpm离心10分钟。
10. 柱结合 将上述操作的上清液转移至吸附柱Spin Column中，13000rpm离心1分钟，弃滤液。
11. 漂洗 将700μl的漂洗缓冲液 Wash Buffer加入吸附柱Spin Column中，12000rpm离心30-60秒，弃滤液。
12. 再漂洗 将500μl的漂洗缓冲液 Wash Buffer加入Spin Column中，12000rpm离心30-60秒，弃滤液。 空柱12000rpm再离心2分钟，除去残留乙醇。
13. 洗脱 将Spin Column按置于新的洁净的1.5ml的离心管上，在吸附柱Spin Column膜的中央处加入30～100μl的水或洗脱缓冲液Elution Buffer，室温静置1分钟，12000rpm离心1分钟洗脱DNA，可立即用于下游分子生物学实验或-20℃保存。
注意：Elution Buffer 组成为2.5mM Tris-HCI (pH8.5),不影响测序和酶切反应，。把水或洗脱液加热于60℃使用时有利于提高洗脱液效率，如果提取的质粒>10kb，请将洗脱液预热至60℃，并适当延长洗脱时间。
质粒DNA浓度和纯度检测
OD260值为1，相当于50ug/ml的双链DNA。也可以通过DNA Marker通过琼脂糖凝胶电泳半定量。
OD260/ OD280比值一般为1.7-1.8，如果洗脱时不使用缓冲液，而使用去离子水，由于受PH值和离子浓度的影响，比值会偏低。
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