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RT-PCR常见问题与分析


2010-9-4 17:03:35
RT-PCR常见问题与分析


 
怎样检测RT-PCR 模板是否降解?电泳还是分光光度计?能看出来吗?模板的浓度不
是很低吗?
参考见解:RT-PCR的模板,如果是一步法,那模板是RNA,检测模板质量的方法就
是检测RNA质量的方法,主要的就是电泳看28S 18S和5S的亮度比;以及通过测
OD260/280的比值来判断。如果用的是两步法,那模板就是cDNA一链,因为cDNA一
链本身是smear,检测其质量只能通过电泳看smear的范围大小大概估计cDNA的质
量。
RT-PCR 与Realtime 有什么区别?
参考见解:RT-PCR是逆转录PCR,但单独提及时,Real-time PCR 也可简称为RT-
PCR,如果其中包含逆转录步骤,就称为RT Real-time PCR。
为什么dNTp在反复冻融的情况下容易失效,其中的分子机理是怎样的;还有没有
其它容易导致dntp失效的原因?
参考见解:脱氧核苷三磷酸(dATP、dCTP、dGTP 和dTTP),dNDP+ATP=dNTP+DP,
这里的ATP和dNTP都是高能磷酸化合物,反复的冻溶,肯定会导致结构的不稳定。
有资料表明,三磷酸核苷贮存在含镁离子的溶液中会促使三磷酸降解,既如果和
有Mgcl2的污染,会加快dNTP的失活。dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关
系,dNTP粉呈颗粒状,如保存不当易变性失去生物学活性。dNTP溶液呈酸性,使
用时应配成高浓度后,以1M NaOH或1M Tris。HCL的缓冲液将其PH调节到7.0~7.5
,小量分装,-20℃冰冻保存。多次冻融会使dNTP降解。在PCR反应中,dNTP应为
50~200umol/L,尤其是注意4种dNTP的浓度要相等( 等摩尔配制),如其中任何一
种浓度不同于其它几种时(偏高或偏低),就会引起错配。浓度过低又会降低PCR产
物的产量。dNTP能与Mg2+结合,使游离的Mg2+浓度降低。
RNA中包含逆转录抑制剂怎么去除?
参考见解:通过乙醇沉淀RNA除去抑制剂。用70%(v/v)乙醇对RNA沉淀进行清洗
。可以加入糖元(0.25μg到0.4μg/μl)以帮助小量样品RNA的恢复。逆转录抑制剂
包括:SDS,EDTA,甘油,焦磷酸钠,亚精胺,甲酰胺和胍盐。将对照RNA同样品
混合,同对照RNA反应比较产量以检验抑制剂。
多糖同RNA共沉淀,怎么处理才能除去多糖?
参考见解:使用氯化锂沉淀RNA以除去多糖。
用于合成cDNA第一链合成的引物没有很好退火 ?
参考见解:确定退火温度适合您的引物。对于随机六聚体,建议在反应温度保温
之前先在25℃保温10分钟。对于基因特异性引物(GSP),可以试一下其他GSP,
或换用oligo(dT)或随机六聚体确定GSP是反义序列。
起始RNA量不够,为保证试验有什么处理方法?
参考见解:增加RNA量。对于<50ng的RNA样品,可以在第一链cDNA合成中使用0.1
μg到0.5μg乙酰BSA。
RNA模板二级结构太多 ?
参考见解:
1 将RNA和引物在不含盐及缓冲液条件下变性/退火。
2 提高逆转录反应温度,对SuperScriptⅡ可以到50℃,对ThermoScript可以到65
℃。注意:不要在>60℃时使用oligo(dT)引物,选择一个在反应温度可以退火的
GSP。
3对于>1kb的RT-PCR产物,保持反应温度≤65℃。注意:不要在高于37℃时使用M
-MLV。如果不需要全长cDNA,在第一链反应中使用随机引物。
引物或模板对残余的RNA模板敏感 ?
参考见解:在PCR前用RNaseH处理。
电泳后出现意外的条带 RNA?
参考见解:
1 被基因组DNA污染: 用DNase I预处理RNA .
2 用于第一链合成的寡聚dT或随机引物 使用基因特异性引物 .
3 PCR的低特异性 优化PCR条件.
RT和PCR时的引物设计是不是一定要先知道目的基因的序列?
参考见解:必须;在RT时,引物设计有3种方法即a:Random 9mers;b:Oligo
dT-Adaptor Primer;和c:特异的下游引物。如果用a和b方法,是扩增的所有的
cDNA(理论上),还要用此产物做PCR 的模板继续扩增。 用于反转录的引物可视
实验的具体情况选择随机引物、Oligo dT 及基因特异性引物中的一种。对于短的
不具有发卡结构的真核细胞mRNA,三种都可。
曾经作过同一管的PCR,内有actin 和目的基因引物。虽然可见到两条均一条带但
图片质量不理想(而且酶量、Mg2+加倍)。如何处理同一管的PCR的各成分的浓度

参考见解:在同一管中做RT,其实没有什么问题,不需要taq魅加量,taq酶本来
就是过量的,(平时做pcr的时候,完全可以再省一些taq酶的, Mg就更不能变了
,一变整个体系就变了。能看到均一条带就很好了。 关键是摸,摸上3、5摸总是
必要的,首先遥分开摸,然后再一起摸,直到摸的好了,还要考虑比较的不同的
模板中的量,所以不建议在同一管中进行,因为还有互相竞争抑制的问题,即使
不同基因之间。
内参可不可以不作?
参考见解:一定要做内参的,每一次不作内参的结果是不可信的。电泳可以不一
起跑,没有关系,计算的是相对表达程度。半定量和定量RT-PCR做的都是基因相
对表达量,不是绝对表达量,除非能准确来自多少细胞,但是细胞还有死的呢。
以电泳为基础的半定量RT-PCR本身是不可信的,作为实验的粗筛是可以的,但不
能作为最终结果的。半定量RT-PCR应该再两管中进行,除非内参基因和目的基因
表达相同,长度差不多,GC含量相似。
有的protocal上要加DTT,作用是什么?
参考见解:DTT是还原剂,可延缓蛋白质的氧化,尤其保护酶中的不饱和二硫键,
从而防止延缓酶的失活。一般来讲,酶的缓冲液中都或多或少地含有DTT 。

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